摘要：生物超弱发光是生物系统在生命活动中的微弱发光现象。为了准确测量生物超弱发光，设计了一种用于生物超微弱发光的专用采集系统。系统的激发光源由单只大功率LED及光学系统构成，用压控恒流源调整LED光照强度，通过电子快门精确控制光探测器的采集时间。测量金心吊兰叶片的延迟发光结果表明，该系统测量精度高、重复性好。
关键词：生物超弱发光；检测；电子快门；压控恒流源
O 引言
生物超弱发光是生物在生命活动过程中，辐射出的一种极其微弱的光子流，分为自发发光和延迟发光。现在已经证明，它与生理代谢、光合作用和细胞分裂等等许多生命过程有关，并且对环境极为敏感。由于生物超弱发光蕴涵着丰富的生命信息，对其探测、分析与解读是近十几年来许多领域共同关心的课题。目前，已有不少研究，展示出其在揭示生命运转机理以及农业、环境保护、医疗、食品卫生等许多领域的应用潜力。由于生物超弱发光的强度较弱，且延迟发光衰减很快，其采集涉及到外来激发光的精确控制和微弱自体发光的实时测量，至今未见成熟的专用仪器，给研究带来困难。鉴于此，本文开发了一类利用LED激发的生物超弱发光采集系统，将LED激发光源、电子快门和光探测器整合在一起，通过单片机精确控制激发光源的光照时间与电子快门的开启时间，使超弱发光尤其是延迟发光重复性测量的精度大大提高。
1 系统总体设计
该系统测量生物超弱发光的时域信息，采用单光子计数探测系统。主要包括激发光源、光源驱动电路、快门控制模块、光探测器、数据采集与处理模块、温度控制模块、暗室和计算机。系统总体结构如图1所示。
样品放在暗室中测量，隔绝外界光线影响。单只大功率超高亮度LED发出的光经过透镜变换为平行光后，均匀照射到样品上，中控模块的单片机精确控制光强和辐照时间，温度控制器保持样品处于恒温状态，快门驱动模块按照预设程序控制电子快门的开闭，PMT进行生物发光的采集。
2 系统硬件设计
2．1 主控制电路
主控电路负责整个系统的正常运行，进行光照时间、光照强度和快门开闭的控制，结构框图如图2所示。主要包括微处理器、压控电流源、光照时间控制、快门开关控制、LCD显示、键盘接口和温度控制模块。
2．2 激发光源及其驱动电路
生物体的自发发光强度较稳定，而延迟发光随时间衰减很快，若将样品用激发光源在暗室外照射后再拿进暗室测量，光照结束时间和测量开始时间的间隔很难控制，对实验人员的技能要求较高。如果采用光源内置的方法，就能很好地解决这个问题。
系统采用单只大功率发光二极管(LED)作为激发光源，通过透镜变换为平行光，保证样品受光面的光强均匀分布。激发光源采用蓝色LED，中心波长为467nm，带宽为20nm，可以满足一般实验要求。也可以根据实验的要求，将蓝色LED更换为红色、绿色和紫色等颜色的LED。
对LED光强的控制通过改变注入LED的电流大小来实现。为了保证实验的精度，要保证LED驱动电流的恒流性，还要使得电路的电流大小可调，实现光源亮度的调节。因此，系统选用精密数控大功率电流源电路作为LED的驱动电路。电路的原理图如图3所示。
驱动电路主要由微处理器、液晶显示与键盘输入、数／模转换与模／数转换、压控恒流源、差动放大电路等子模块组成。
2．2．1 压控恒流源
压控恒流源是LED驱动电路的重要组成部分，它的功能是通过调节控制电压来达到对电流的控制，它的性能决定了LED亮度的稳定程度。压控恒流源的电路如图4所示，U1B和R8，R9构成电压跟随器，运放的高输入阻抗，近似可以认为U1B没有分流作用，则流经V2的电流全部流入负载RL，并且有V3=V2。U1C和电阻R10，R11，R12构成反相器，有V4=-V3=-V2。U1A和电阻R1，R2，R3，R13构成反向加法器电路，输入信号分别为Vi和V4，输出电压V1=-(Vi+V4)，又因为V4=-V2，所以输出电压V1=-(Vi-V2)。运放UB1并无分流作用，因此电阻Rm两端的电压为Vm=V1-V2=-Vi，流经Rm和负载RL的电流相等，都为I=Vm／Rm=-Vi／Rm。可以看出，负载上的电流由输入电压Vi和电阻Rm共同决定，只要这两个量不变，电流就会保持恒定。通过改变数模转换器的输出电压，即可调节负载RL上的电流。
负载RL是大功率的LED，所需要的驱动电流一般在0～300 mA，为了保证恒流电路的功率输出，加入了电流扩展电路。该扩展电路采用简单常用的图腾柱式电流扩展方法。功率三极管使用大功率的2N1346，同时连接散热片并加装散热风扇，以保证电路稳定工作。
2．2．2 差动放大电路
输出电流经采样电阻Rm采样，接入差动放大电路的输入端。在电流源电路中，采样电阻的精确程度和温度稳定性直接关系到电流输出的稳定性。因此系统中采样电阻使用精密金属膜电阻，该电阻温漂小于5x10-5℃-1，阻值为2 Ω，额定功率为10 W。
差动放大电路使用较常用的仪用放大器，电路原理如图5所示。
仪用放大电路具有较高的输入阻抗，能够避免采样电路对电流源的影响；同时又具有较大的共模抑制比，保证采样的准确性，避免干扰。由于采样电阻Rm上流经的电流变化范围是0～300 mA，范围较大，所以将差动放大电路的放大倍数设置为1。
2．2．3 数／模和模／数转换
数／模转换采用C8051F021单片机内部集成的DAC1，DAC的输出在每次中断时根据A／D的采样值计算后进行更新。
模／数转换采用单片机内部集成的12位逐次逼近寄存器型ADC。A／D和D／A的电压基准VREF由片外的LM336基准稳压源提供。
2．3 快门控制
为了防止LED光强对PMT造成损伤，在样品室与PMT之间加装了电子快门来保护PMT。开启LED时，快门关闭；激发光源照射样品结束时，LED熄灭，快门打开，PMT开始采集样品的发光。由于延迟发光快速衰减，为了保证能够及时采集延迟发光，该系统采用的电子快门的响应时间为1μs，快门驱动电压为(12±O．1)V，电路接通则快门开启，断开则快门自动关闭，控制简单。但电子快门对电压稳定度要求较高，需要采用单独的稳压电源供电，否则有可能因电压波动造成快门意外关闭。
电子快门驱动电路如图6所示，开关管连接单片机P2．7口，由单片机控制快门的开启和关闭。当单片机P2．7口输出为“0”时，快门关闭；当单片机P2．7口输出为“1”时，快门打开。用示波器测量驱动电路的延迟时间在1μs以内，考虑到快门的延迟也在1μs，可以认为快门总体的延迟对测量的影响可以忽略。
3 系统软件设计
系统软件部分采用模块化设计方法，将整个程序划分为若干模块，通过主程序对各个子模块的调用，将模块连接成一个完整的程序。
根据系统控制功能的要求，确定了系统软件的主要功能有：系统初始化，寄存器设定，键盘设定初始值(光照时间，快门开启时间，流过LED的电流值大小)，液晶显示控制，电子快门控制。根据软件的功能要求，图7给出程序总体流程结构图，图8表示各模块之间的逻辑关系。
4 仪器测试
系统硬件连接完成，软件调试通过后。接着对仪器进行了测试。
4．1 光源测试
使LED驱动电路的电流在O～300 mA范围变化，测试LED的发光强度。测出驱动电流与光强的关系如图9所示。
4．2 暗噪声测试
图10使用本系统测试的本底值，测量时的温度为24℃，积分时间为0．5 s，PMT加载负高压1 000 V。由图10可见，暗室的背景噪声在50 c／s(counts persecond)之下，计算得出本底噪声的平均光子计数为27．48 c／s，结果较为理想。
4．3 样品测试
完成系统的研制后，对金心吊兰叶片的生物光子辐射延迟发光进行检测。首先将样品放入暗室中黑暗处理5 min，而后用蓝色LED光源光照1 min，测量其延迟发光衰减曲线，测量时间50 s，间隔1 s，重复测量三次，探测结果如图11所示。分别对三组测量数据之间的相关度进行拟合，结果表明，三组测量数据之阿的相关系数均接近O．999(见图12(a)～(c))，结果表明该系统测量具有良好的可重复性，测量精度高。
5 结语
本文设计了用于测量生物超弱发光的专用测量系统，系统的激发光源由单颗高亮度大功率LED及光学系统构成，用压恒流源调整LED光照强度，通过电子快门精确控制光探测器的采集时间，暗室的背景噪声在50 c／s之下。应用本系统测量金心吊兰叶片的延迟发光的结果表明，该系统测量精度高、重复性好，得到了较理想的测量结果。