HS9600全自动核酸提取仪的研制
2009-02-26
作者：盛占石1,张继军2,潘天红1,营
摘 要: 将核酸提取工艺与自动控制相结合,研发了HS9600全自动核酸提取仪。该仪器以机械臂运动控制为核心,结合移液器定量控制与试剂技术,实现了核酸的分离与纯化。文中详细介绍了机械臂位置控制系统、移液器控制系统、温控系统等关键模块的设计方法,并描述了系统软件的功能和设计思想。检测证明该仪器运动控制稳定,可靠性好,提取效果优,自动化程度高。
关键词: 核酸提取;机械臂;移液器;温度控制
基因重组、DNA序列分析、基因诊断与治疗、基因扩增和对目标DNA的定量分析是科学研究与临床诊断的基本方法,而这些检测方法都需要从人体的血液、精液或者其他分泌物中提取核酸才能进行。因此,核酸提取效率与纯度的高低,直接影响后期研究工作的开展以及实验结果的准确性。
目前国内多采用半自动,甚至手工方法提取核酸。手工方法耗时、繁琐、核酸提取效率低,并且容易导致假阴性与交叉感染[1,2]。鉴于这种情况,课题组从多年的手工操作中吸取经验,结合试剂技术,自行研制了具有自主知识产权的HS9600全自动核酸提取仪,利用机械臂完成核酸的提取动作,实现无交叉感染、无菌的操作过程。该仪器大大减轻了操作人员的劳动强度、减少了人工操作过程中的失误和感染,增强了生物制备过程的安全性、有效性,加快了核酸提取的自动化进程,为分子生物学的研究提供了一种现代化的工具。
1 基本原理
核酸是细胞的一种主要成分,支配着蛋白质的合成,主宰着人体的生长、发育、繁殖、遗传及变异等一切重大的生命活动,与人体的新陈代谢、免疫功能调节、健康长寿有着极其密切的关系,而且起着重要的、决定性的作用。核酸在细胞中总是与各种蛋白质结合在一起,因此,核酸提取是生命科学研究的首要前提。
核酸提取(核酸的分离与纯化)主要是指将核酸与蛋白质、多糖、脂肪等生物大分子物质分开,但在分离核酸时,应保证核酸分子一级结构的完整性,并排除其他分子污染。核酸提取方法一般包括细胞裂解、酶处理、核酸与其他生物大分子物质分离、核酸纯化等几个主要步骤,而每一步骤又可由多种不同的方法单独或联合实现[3]。
首先通过物理、化学或酶解作用裂解细胞,使核酸释放出来,并去除与核酸结合的蛋白质以及多糖、脂肪类等生物大分子的过程。在此基础上,沉淀核酸、去除盐类和有机试剂等杂质,从而得到纯化的核酸。该过程通常采用离心澄清的方法,操作时费时费力。近年来,出现了磁珠分离技术,利用磁珠在一定条件下对核酸具有很强亲和力的特点,吸附核酸。当条件改变时,磁珠又可以与其吸附的核酸分离,从而得到纯化的核酸。这种方法简便、高效、易于操作,是目前核酸提取的主要方法[4]。
为提高效率,降低核酸提取过程的失误与污染,打破磁珠试剂在核酸提取技术上形成的技术和市场垄断,课题组经过几年研制,自主开发出适用于核酸纯化的高性能吸附剂,为国内自动化提取纯化核酸开辟了新的技术发展路线;在此基础上,研发了HS9600全自动核酸提取仪,替代了传统的手工操作,实现批量化提纯。其提取工艺如图1所示。
由图1可知,HS9600全自动核酸提取仪是基于膜分离法而设计的,在细胞膜裂解的基础上,通过吸附试剂,使核酸成为大分子(结合核酸),实现核酸分子与其他生物分子分离;再用洗脱液,使核酸脱离,变为小分子,并通过滤膜得到纯化的核酸。其过程如下:
(1)裂解:在样品中加入裂解液,打碎细胞膜;
(2)吸附:在样品裂解液中加入吸附剂,充分混合,利用核酸的特异性,使其吸附到吸附剂上,蛋白质等分子则不被吸附,再利用滤膜,使核酸分子与其他生物分子分离;
(3)洗涤:将吸附的核酸反复洗涤,去除杂质;
(4)洗脱:将吸附的核酸烘干,然后转至洗脱缓冲液中,核酸就从吸附剂上被洗脱下来,变成小分子形式,通过滤膜,得到纯化的核酸。
2 系统设计
HS9600全自动核酸提取仪由机械与电控两部分组成。其中,机械部分由机架、纵向驱动部件、横向驱动部件、升降机械臂、烘干器及工作台等零部件构成。其结构布局按照核酸提取的基本流程分为5个工位。工作台上分别放置裂解液、吸附剂、洗涤液、洗脱液、一次性枪头、样品以及空试管等。而电控部分由控制器、步进电机驱动器、步进电机、温度传感器和加热器等部件组成。当提取仪工作时,控制系统驱动机械臂横向和纵向移动,自动进行装卸枪头、定量取液、吹打、排液、加温等工序而完成所选定的工艺流程。其结构框图如图2所示。
由图2可知,整个控制系统采用上下位机结构模式,下位机始终处于监听状态,其所有任务受上位机指派并完成机械臂的三维运动、自动装卸枪头、定量吸液、吹打溶液、控温等,实现全自动无人操作的核酸提取过程。
2.1 机械臂位置控制系统
核酸提取仪的主要任务是把裂解液、吸附剂、洗涤液分别与血样混合在一起,并充分吹打、排空,通过加热到某一特定温度,再通过添加洗脱液提取核酸的过程。整个操作要求机械臂定位准确。一是因为机械臂上的移液器在向血样添加不同液体时,要多次插进同一血样试管里;二是在取液中,有一道工序是取枪头,即要把枪头自动装到移液器上,此时,在机械臂的升降运动中,要求位置误差不能超过0.1mm。因此,系统采用了滚珠丝杆精确定位。
整个机械臂的三维运动由步进电机控制,其驱动器采用SH-2034M,通过上位机计算得到位移的脉冲数,向单片机发出相应的位移指令,单片机通过I/O定时发出高低电平信号控制步进电机的转动和停止。
步进电机的软件设计分启动升速、途中匀速、到位降速三步进行,采用如图3所示的梯度曲线逼近加减速曲线,并利用单片机定时器中断方式控制步进电机的速度。这个功能靠不断改变定时器装载值的大小实现。
2.2 移液器控制系统
HS9600提取仪的研制是围绕高精确度多通道移液器这个关键部件开展的。向血样中添加试剂准确与否直接关系到核酸的纯化程度高低,在对电子移液器进行充分的市场调研之后,本提取仪选定由芬兰BIOHIT公司生产的ePET系列电子移液器(12通道,移液范围50μl～1200μl)。但该电子移液器并没有标准的计算机接口,需要对其进行二次开发,以便于全自动提取仪定量移液。
移液器的工作原理是微电机带动活塞运动,通过吸筒吸取定量的液体,吸液的多少由光电检测电路判断。整个电路由微电机驱动电路与脉冲检测电路构成,其微电机驱动电路如图4所示。
驱动元件选用场效应管IRF3205[5],其中1、4配对构成正向控制电路;3、2配对构成反向控制电路。此外,为使系统调试、维护方便,用2个发光管指示微电机的工作方式:红灯表示电机正向转动;蓝灯表示电机反向转动;若2个灯都不亮,表示电机不工作。
(1)D1=1,场效应管全部截止,电机不工作;
(2)D1=0,D2=0,场效应管1、4导通,3、2截止,电机正转(吸液);
(3)D1=0,D2=1,场效应管3、2导通,1、4截止,电机反转(吹液)。
工作中,设定好吸液量之后,启动微电机工作,其运行速度快慢由PWM占空比实现。PWM的占空比越大,电机转动的速度越快。
移液器旋转的脉冲检测电路如图5所示。在微电机的轴上装有一个轮盘,轮盘上开有均匀间隔的豁槽;发光管通过豁槽,将光投射到前后放置的T1、T2两个光敏三极管上;两个光敏三极管的集电极1、2上产生两路正交的脉冲信号 ,这两路正交的脉冲经过信号处理电路后,从信号处理电路的3和4输出。
若微电机正转,即移液器吸液,则在信号处理电路的3端得到一系列脉冲,其脉冲频率与1、2脉冲频率相同,而4端始终是低电平信号。
若微电机反转,即移液器吹液,则在信号处理电路4端得到一系列脉冲,其脉冲频率与1、2脉冲频率相同,而3端始终是低电平信号。
单片机用两个计数器分别计数3和4上的脉冲,就可以感知电机转动的方向和角度大小,从而间接检测吸液筒的活塞运动距离,最终控制吸液、吹液量的多少,以实现提取仪自动操作。
2.3 温控系统
为了提高核酸提取纯度,在充分洗涤的基础上,需要将吸附剂结合的核酸烤干,而温度的高低与温度的波动对核酸的提取影响也比较大。因此,需要一个恒定的温度进行烘烤,才能取得满意的核酸提取结果。
在核酸提取仪中,温控系统包括温度控制与温度测量两部分,温度控制类似于电阻炉炉温调节,调节器采用积分分离、增量式PID调节器,可以有效抑制过冲现象。其控制器参数采用实验方法,由试凑法确定。另外在控温过程中,根据当前温度与设定温度偏离的远近,采用不同的比例系数,抑制控温过程的超调与纯滞后环节。其计算公式如下:
Δu(k)=kP(k)[e(k)-e(k-1)]+kLkIe(k)
式中,e为偏差;Δu为控制增量;kP为比例系数; kI为积分系数;ε为偏差的门限值;k0为常数;β为可变比例系统的增益,它与偏差成反比关系。
为避免模拟电路技术设计中面临的一系列问题(如引线误差补偿和信号调理电路的误差等),温度测量部分采用美国Dallas半导体公司推出的数字温度传感器DS18B20[6],它具有独特的单总线接口,仅需要占用一个通用I/O端口即可完成与微处理器的通信;其测量温度范围为-55℃～+125℃,具有可编程的9位～12位A/D转换精度,测温分辨率可达0.0625℃,大大简化了电路设计,并能满足系统性能要求。
2.4 系统软件
全自动核酸提取仪的软件由上位机软件和下位机软件两部分组成。
在单片机上运行的软件称为下位机软件,采用汇编语言开发。下位机软件采用模块化设计方法,主要包括(1)通信模块,与上位机通信,接收上位机的命令,并作出应答;(2)控温模块,根据上位机设定的温度进行控温;(3)机械臂移动模块,根据上位机的命令进行机械臂的移动;(4)移液器控制模块,根据上位机的命令进行吸液、吹液和脱枪头等。
在PC机上运行的软件称为上位机软件,采用VB.NET语言开发。上位机软件主要有三个功能:(1)与下位机通信,命令下位机执行控温、机械臂移动、吸液、吹液和脱枪头等动作;(2)系统各种数据的管理和处理;(3)提供方便的人机对话界面,使用户可通过键盘、鼠标和显示屏,实现核酸提取工艺的编辑、仪器运行状态的显示和核酸提取过程的控制。其软件结构见图6。
上位机软件主要由五大模块构成:(1)参数设置模块,完成各个提取动作的参数编制,主要是烘干区温度、各个溶液(包括:裂解液、洗涤液、洗脱液)的每次移液量与添加量,机械臂升降的位置,吹打的位置等参数设置。(2)提取工艺组合模块,本系统配有几个常用标准动作:裂解、吹打、洗涤、烘干、洗脱、延时等,可根据实际需要将标准动作进行组合,简化了规程的设计。(3)提取模块,主要功能是通过控制机械臂的运动,带动核酸在不同缓冲液之间的转移。这些功能的实现都是靠上下位机之间的数据交互,依据编辑的提取规程,进行核酸的分离与纯化。(4)系统维护模块,该模块方便了计量工作的鉴定和维护工程师对仪器的各个部件进行测试,如:移液量的标定、温度恒温测定、机械臂位置自检等。
3 仪器性能
HS9600全自动核酸提取仪(1台)经检测,其安全指标和性能指标均符合行业标准。其中移液精度与温控精度的实测曲线如图7和图8所示。
图7为分别设定移液量为100μl、200μl、300μl的条件下,提取仪自动吸取蒸馏水所得到的曲线。由图可知,在100μl时,移液器的最大绝对误差为1.4μl;在200μl时,最大绝对误差为3.9μl;在300μl时,最大绝对误差为3.4μl。满足预期设计的要求。
图8为分别设定目标温度为50℃、70℃、90℃时,提取仪的控温曲线。可以看出,在设定温度为50℃时,系统的最大绝对误差为0.3℃;在70℃时,最大绝对误差为0.4℃;在90℃时,最大绝对误差为0.5℃。仪器的控温精度可达±0.5℃。
仪器的各项性能指标如下:
(1)加热温度范围:50℃～100℃;
(2)加热控温精度:±0.5℃;
(3)处理样品容量:50μl～150μl;
(4)加热模块均匀度:±2℃;
(5)移液精度:±5μl;
(6)移液准确度:±5μl;
(7)移液均匀度:±5μl。
HS9600全自动核酸提取仪采用模块化组合设计的思想,由上下位机依据自己的特点,分别承担不同的任务,大大提高了仪器的自动化程度,替代了传统的手工操作,实现批量化提纯,可以一次处理96个样品。
与传统的手工操作过程相比,该仪器不仅节约了大量时间,而且避免了样本交叉污染,满足高通量实验的要求。自动化操作更保证了实验结果的稳定可靠,满足了便捷、高效、准确的核酸检测要求。该仪器与达安核酸提取吸附剂配套使用,打破磁珠试剂在核酸提取技术上形成的技术和市场垄断,为广大客户提供了更为全面和完善的实验解决方案。
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