0 引言

　　目前，食品安全问题日益突出，如何快速检测食品中微生物是否达标是国内外食品微生物检测人员共同关注的焦点。传统的食品卫生达标检测方法采用基于细菌培养的平皿法，该方法及结果得到各种标准的认可，但是这种细菌培养的方法具有一定的局限性，如：不同的培养基和培养方法只适合检测特定的微生物，如霉菌、厌氧菌、藻类等均有特定的检测方法，此外培养法影响结果的人为因素较多，操作周期长达1~5天。简而言之，传统的培养法检测微生物存在检测效率较低、验证周期长、培养条件多样、难以多种菌类品种同时检测等诸多限制，难以适应卫生检验机构对食品中微生物快速检测的需求。

　　本文主要阐述一种基于ATP生物发光原理测定微生物含量的方法(即ATP检测技术[1])，介绍了该系统的软、硬件平台的设计原理，通过采用生化反应、传感器和电子系统相结合的方法，实现对溶液中细菌数量的检测，最后给出了详细的测试数据和分析结果。

　　该微生物检测仪具有检测周期短、操作简易等优点，可在许多领域替代传统测试方法，从而大大提高效率，为食品安全提供坚实的保障。

　　1 系统硬件设计与实现

　　系统硬件框图如图1所示。系统从信号采集模块得到源信号，经过微控制器模块的处理和控制后，最终将结果在触摸屏上显示并存储。

　　微控制器模块采用了STM32F407。光电倍增管、电压放大器、电压比较器构成了信号采样模块。高压模块为光敏器件提供高压电源。电机模块主要为黑暗测试环境提供一道门禁，并用光电传感器监测门禁是否正常开关，形成反馈机制。用户界面选取触屏的交互方式，方便用户操作和界面定制。存储模块由microSD卡上搭建文件系统，供PC机查看存储的历史记录。

　　1.1 电源模块

　　系统采用7组电源供电，如图2所示。

　　当无外接电源时，由内置12 V蓄电池供电，接入外部电源后,将对蓄电池进行充电；待蓄电池充满电后,将借助二极管断开蓄电池的对外供电通路，以延长蓄电池寿命。

　　1.2 微控制器模块

　　本系统采用意法半导体的STM32F407微处理器。该微处理器为32 bit、ARM cortex-M4核、主频可达168 MHz，提供210 DMIPS的运算能力，具有1MB的可编程闪存（Flash）和192 KB的SRAM。系统使用到的MCU外设功能包括：

　　TIMER输入捕获采样脉冲信号；DAC调节输出电压，ADC监控高压模块输出电压反馈；TIMER PWM输出控制电机模块；FSMC总线输出数据到显示屏，SPI总线接收触摸输入信号；SDIO总线与microSD卡通信，读写历史记录和配置参数；USB与PC机进行MassStorage类通信。

　　1.3 信号采样模块

　　信号采样模块采用光电倍增管采集微生物发光强度，并转化为微弱电脉冲信号。该电脉冲信号是整个系统的信号源头，后续的信号处理、显示以及存储都针对该核心信号源进行运算分析。因此光电传感器的选择、放大整形电路的设计以及信号捕获方式的选择是系统硬件设计中的重中之重。

　　1.3.1 光电倍增管

　　由于微生物发光微弱、短暂、稳定性差、发光曲线呈类抛物线型且信号易被淹没，故本设计采用端窗式光电倍增管，它具有高信噪比、高灵敏度和高稳定性特点，可最大程度地满足对微生物采光的需求。

　　光电倍增管内部构造示意图如图3所示，光电倍增管的光电阴极和阳极之间还放置多个瓦形倍增电极，使用时相邻两倍增电极间均加高压。光电阴极受光照后释放出光电子，在电场作用下射向第一倍增电极，引起电子的二次发射，激发出更多的电子，然后在电场作用下飞向下一个倍增电极，再次激发出更多的电子。如此电子数不断倍增，阳极最后收集到的电子可增加 104～108倍，这使光电倍增管的灵敏度比普通光电管要高得多，可用来检测微弱光信号[2]。

　　生物发光的亮度范围是10-17～10-7 mol/cell，波长为300 nm～600 nm之间，系统需要的光电倍增管必须对照此范围来确定型号。图4给出了所选用的光电倍增管光谱响应特性曲线，从中可以看出光电倍增管转换效率(阴极灵敏度)随入射光波长的变化改变[4]，其波长测量范围包含300 nm～600 nm区间，且在420 nm处灵敏度最高，适合本系统需求。

　　该光电倍增管属于脉冲型倍增管，它适用于光强不大的场合，可将采集到的微弱光信号转化为微弱电脉冲信号。由于微生物发光强度非常低，在0～106个光子级别，所以倍增管的输出电压大小为微伏到毫伏级别，需要外部电路进行放大。

　　外部处理采用CC228P作为光电管的高压电源，光电倍增管输出微弱的电脉冲信号，经过AD603构成的电压放大器放大，以及电压比较器整形，电路最终输出了幅度在0～3.3 V之间的标准脉冲。

　　电路输出的标准脉冲的宽度为2.5 ns，频率随脉冲数的大小而变化，最大频率范围约为10 MHz。ATP浓度不同时，光电倍增管输出脉冲示意图如图5所示。

　　1.3.2 MCU定时器输入捕获

　　由于光电倍增管产生的电脉冲在1 Hz～12.5 MHz，频率较高，故采用STM32定时器的输入捕获计数法。软件配置好定时器捕获模式后，定时器便进入硬件工作，从而有效提高处理器的工作效率。

　　信号采样模块使用了输入捕获模式以测量脉冲频率。当检测到TIM1_CH1上出现下降沿时，计数器当前值TIM1_

　　CNT加1，存入捕获比较寄存器TIM1_CCR1中，完成一次捕获。当达到设定阈值(65535溢出)，则发生捕获中断，进入中断处理函数，自定义的整形couter自增1。TIM2每1 s进一次中断，读取TIM1中的couter和TIM1_CNT，则这1 s的脉冲数为：conter65535+TIM1_CNT。

2 系统软件设计与实现

　　微生物检测系统软件部分的设计与实现，涉及功能实现和交互设计两大任务。鉴于本系统功能需求较为复杂，触摸界面与控件繁多，需要存储用户配置和历史记录，并在PC机上以文件形式读写，本系统选择采用μC/OS-II+μC/GUI+FatFS+USB的软件结构作为中间件，其通用的上下层接口，便于编写规范的程序以及后续升级。本章主要围绕中间件移植和应用层实现两方面展开详细介绍。

　　2.1 中间层详细介绍

　　系统软件架构设计的目标从微观上讲，需要实现控件对应功能，以及界面的状态切换。基于上述要求，系统软件围绕软件结构大致可分为三层：底层硬件驱动程序，中间层OS、GUI、文件系统以及上层应用层用户程序。

　　本系统中间层包括μC/OS-II、μC/GUI、FatFS和USB协议，下面介绍上述模块的移植以及应用层调用接口。

　　2.1.1 μC/OS-II移植

　　μC/OS-II是一个广泛应用于微控制器的实时操作系统内核，它包含了任务调度、任务管理、事件管理、内存管理和任务间的通信与同步等基本功能，但是没有提供输入/输出管理、文件系统、网络等额外的服务[5]，所以本系统图形用户界面和文件系统都需要单独移植。

　　（1）μC/OS-II软件体系结构

　　μC/OS-II软件架构主要包括以下5大模块：应用程序、μC/OS-II内核代码、μC/OS-II与硬件相关的代码、BSP层、Cortex-M4内核。其中需要自行编写的主要是应用程序，移植时需要修改与硬件相关的代码，其余部分基本可以沿用μC/OS-II的开源代码。

　　(2)实时操作系统μC/OS-II内核移植

　　在移植过程中，需要修改的软件主要是与处理器相关的3个文件，包括设置库文件OS_CPU中与处理器和编译器相关的代码，用C语言编写的6个与操作系统相关的函数C文件，用汇编语言编写的4个与处理器相关的函数汇编文件。需改写OS_CPU.H、OS_CPU.C、OS_CPU_

　　A.ASM、startup_stm32f4xx.s、os_cpu_a.asm.s文件[6]。

　　2.1.2 μC/GUI移植

　　Micrium公司开发的μC/GUI是一种通用嵌入式应用的图形界面软件，它可为任何使用LCD图形显示的应用提供一套高效的独立于处理器及LCD控制器而设计的图形用户接口，适用于单任务或是多任务系统环境，通常和μC/OS-II结合使用。

　　本系统采用μC/GUI 3.90a版本，该版本优点是移植时需要改动的地方少，LCD底层驱动获取方便，不依赖于μC/GUI官方驱动。

　　μC/GUI系统移植主要涉及底层驱动配置文件，为了适用个性化的LCD、LCD控制器以及触摸屏硬件，主要需要修改LCDConf.h、GUIConf.h、LCD底层驱动这3个文件。

　　2.1.3 USB驱动

　　由于USB总线具有通用性、稳定性、便利性、高传输速率等良好特性[7]，系统选择USB总线协议实现上下位机通信。根据系统需求，选用USB2.0规范，运行在全速模式（12 Mb/s）下，PC机作为主机，本系统作为设备。

　　2.2 应用层详细介绍

　　应用层软件按系统功能需求分为5大模块：数据采集与处理、参数设置、数据校正、人机交互和历史数据查询。

　　系统上电后首先初始化各硬件模块，一切正常之后进入用户界面。用户界面可设置为英文或中文显示。在主菜单界面中点击相应控件可进入下一级界面，包括：基本测试、测试选择、测试设定、测试历史。

　　进行测量时，应首先选定序号，默认为上次操作时选择的序号。测量方式可设定为基本测试或平均测试。基本测试时需要自定义等待时间、测试时长。平均测试则需要自定义等待时间、测试时长和平行个数。

　　在GUI中，使用GUI_WIDGET_CREATE_INFO结构体表示各个界面，用于存放界面中的控件种类、数量、ID，结构体原型如下：

　　struct GUI_WIDGET_CREATE_INFO_struct

　　{

　　GUI_WIDGET_CREATE_FUNC* pfCreateIndirect;

　　const char* pName；/*控件指针*/

　　I16 Id；/*ID号，在对话框中唯一标示*/

　　I16 x0,y0,xSize,ySize；/*定义位置和大小*/

　　U16 Flags；/*控件的特殊创建标志（可选）*/

　　I32 Para；/*控件的特殊参数（可选）*/

　　}

　　界面消息回调函数在发生事件时将被自动调用，并根据发生事件的ID进入相应分支进行处理：static void _cbCallback_xxx (WM_MESSAGE* pMsg)。

3 测试与总结

　　本系统在研发过程中进行了大量前中期测试，为系统软硬件设计和调整提供了大量依据。以下将展示系统开发阶段的测试结果，并给出系统功能与性能测试报告。

　　3.1 仿真测试

　　理论上，供给生物发光的ATP含量范围为0～10-8 mol，对应的RLU脉冲频率范围是0～8 MHz。在后端数字系统的开发阶段，可以借助频率发生器产生电脉冲信号来模拟RLU，用以测试后端系统对不同频率脉冲的处理能力，且该频率精确稳定，可以消除外部因素的干扰[3]。表1列出了测试结果，数据表明STM32F407的定时器模块可以检测到0 Hz～12.5 MHz的矩形脉冲，超出12.5 MHz后，计数值达到瓶颈，无法继续往上计数。由于实物RLU值主要范围在0～8 MHz，而且对于超出范围的样液，可以通过稀释的办法使其ATP的值下降到计数范围内。

　　由表1可见，采用定时器硬件计数捕获输入法测定的误差在个位数范围内，也在本系统允许误差范围内，证明定时器硬件计数设计是合理的，适合系统需求。

　　3.2 试剂实物测试

　　本系统整机测试流程为：开机自检校正、取样、混合、测量、读数，如表2所示。

　　光电倍增管需要高压供给，其供电电压应跟随灵敏度而改变。若电压太高，增益噪声呈倍数增长，会影响数据准确性；若电压太低，检测不出低含量的微生物。为此可通过调节供电电压，寻找合适的灵敏度。表3列出了在不同电压下，光电倍增管捕获光子数，即RLU值。

　　从表3可以看出，样机在电压调至850 V以上出现噪声，1 310 V以内噪声RLU小于20；电压越大时，仪器灵敏度越高，本系统选用1 250 V为常态下测量电压，如果灵敏度太高，噪声将影响测试数据准确性。使用者可以根据待测品的性质，在测试前进入调试界面调整输入电压。

　　对不同浓度的待测品，0.5 mL体系下的线性与灵敏度测试结果如表4所示。

　　检测灵敏度为10-14 mol ATP，在测试范围内有近线性关系。ATP含量若低于10-14 mol的级别，本仪器无法精准测量。

　　在0.5 mL体系下的线性与灵敏度曲线如图6所示。

　　0.3 mL体系下的线性与灵敏度测试结果见表5。

　　0.3 mL体系下的线性与灵敏度曲线见图7。

　　样机变压电源可调电压上限为1 310 V，在测试范围内，电压与RLU成正比。以中等发光试剂测试，最高检测灵敏度为ATP 10-18 mol，但在ATP浓度低于10-16 mol时，可信度较低（重复性差）。

　　在测试范围内，ATP的量与RLU有较好的线性关系，线性拐点出现在ATP10-14 mol～10-15 mol之间；在可调电压范围内，空机噪声低于30 RLU，通常在10～25之间上下波动[10]。

　　本系统测试所用样液为标准ATP溶液，向该溶液滴入荧光素酶，ATP能量定量转换为光能，所以该系统在交付时，除了仪器本身以外，还需要配套化学试剂。本系统采用广东省微生物研究所研制的发光试剂盒，可在各类水、饮料和相关食品中应用，一次测量在30 s以内，整个测量过程不到30 min。测试结果与美国仪器对比，在可测量范围内结果相近，且稳定、重复性高。

　　表6给出了本仪器的性能指标。

　　最后，对本仪器的相关性能与传统的细菌培养法进行了比较，如表7所示。

4 总结

　　从测试数据可以发现，ATP含量和细胞数、发光值RLU都存在线性关系，测定荧光信号的强度，便可得知待检目标被细菌、食物残渣等污染的程度，因此检测ATP可以作为判断食物洁净的指标。

　　系统基本符合预定的设计目标和效果，可快速检测样品中微生物含量，具有测定周期短、效率高、判断标准清晰以及测量范围宽（10-7 mol～10-16 mol）等特点。

　　同时，与传统的检测方法相比，基于测量ATP浓度来间接确定微生物含量的方法能满足测试覆盖率高达80%以上的微生物种类，可广泛应用于政府监督部门、第三方检测机构、食品加工行业、食品和原材料分销商、饭店、宾馆食品操作间、医院等领域。

　　参考文献

　　[1] 王茁.ATP荧光微生物检测法在食品卫生监控领域中的应用与展望[J].中国食品卫生杂志，2004(3).

　　[2] 王海科，吕云鹏.光电倍增管特性及应用[J].仪器仪表与分析检测，2005(1).

　　[3] RODA A，GUARDIGLI M，MICHELINI E，et al.Biolumines-cence in analytical chemistry and in vivo imaging[J].Trac Trends in Analytical Chemistry，2009，28(3)：307-322.

　　[4] 刘君红，刘俊勇.光电倍增管线性特性、时间、特性参数调试[J].核电子学与探测技术，2005，25(6)：768-771.

　　[5] JEAN J.Labrosse，邵贝贝.嵌入式实时操作系统μC/OS-Ⅱ（第2版）[M].北京：北京航空航天大学出版社，2003.

　　[6] 卢有亮.嵌入式实时操作系统μC/OS-Ⅱ原理与实践[M].北京：电子工业出版社，2012.

　　[7] USB通用串行总线技术规范简介[DB/OL].2008，http：//www.usb.org./devel-oper.

　　[8] STMicroelectronics.STM32F407xx Data Sheet Rev.3. May 2012.

　　[9] 李利霞，常超.ATP生物发光法检测拭子的研究进展[J].粮食科技与经济，2010(5).

　　[10] 徐烨.基于ATP生物化学发光法微生物含量检测仪[D].上海：华东师范大学，2007.